Принцип метода: молибденовокислый аммоний с раствором перекиси водорода образует комплексное соединение желтого цвета. Каталаза разрушает перекись водорода по следующей формуле:

2Н 2 О 2 = 2Н 2 О + О 2

Степень снижения интенсивности окраски раствора пропорциональна активности каталазы.

Ход работы: в опытную и контрольную пробирку вносят по 4 мл 0,03% раствора перекиси водорода, в опытную пробирку добавляют 0,2 мл гемолизированной крови (разведение 1:1000). Ингибируют пробу 20 минут при 37 0 С. Затем в обе пробирки вносят по 2 мл раствора молибдата аммония, а в контрольную – дополнительно 0,2 мл гемолизата. Перемешивают. Измеряют оптическую плотность опытной и контрольной пробы против воды при синем светофильтре. Определяют активность каталазы по формуле:

(Е к – Е 0) . 5600

А= -------------------, где

А –активность каталазы (мкмоль Н 2 О 2 / мин на мл крови);

Е к –экстинция контроля; Е 0 – экстинция опыта;

В – время инкубации, мин; 5600 – коэффициент

В норме активность каталазы составляет 135 мкмоль Н 2 О 2 / мин на мл

крови (в слюне –12-16 мкмоль). Активность каталазы в крови может снижаться при анемии, опухолевом росте, туберкулезе, некоторых других заболеваниях, а повышаться при острых воспалительных процессах (в слюне – при воспалительных процессах слизистой ротовой полости).

Аргументировано и кратко ответить на следующее:

1. Может ли осуществиться окисление СН 3 - СН 2 - СН 2 - ОН ®

СН 3 - СН 2 - СН = О в бескислородной среде? Какие условия для этого необходимы? Написать схему реакции.

2. Может ли и при каком условии в бескислородной среде произойти окисление по типу СН 3 - СН 2 - СН = О ® СН 3 - СН 2 – СООН? Укажите необходимые компоненты, составьте схему реакции. Как пояснить появление двух атомов кислорода в продукте реакции.

3. Является ли кислород исключительным (единственным) конечным акцептором водорода в цепи тканевого дыхания и вообще в биологическом окислении?

4. Почему окисление в живой природе отождествляли с горением вне организма? Назовите внешние признаки сходства между горением и процессом окисления в организме. Назовите отличия между этими процессами.

5. Напишите реакции дегидрирования соединений:

R-СН 2 –СН 2 - R; R-СН=О; R- СНОН -R; R-СН=СН-R

6. Установите соответствие:

Редокс-потенциал: А.+0,82; Б. +0,10; В.+ 0,25; Г.- 0,22

Компонент ЦПЭ: 1.Убихинон; 2.Кислород; 3.ФМН; 4.Цитохром

7. Какие из перечисленных соединений являются субстратами ФАД-зависимой дегидрогеназы: глюкоза, сахароза; янтарная кислота; глицериновый альдегид, НАДН + .

8. Напишите схему переноса электронов и протонов от изоцитрата на кислород (изоцитратдегидрогеназа – НАД-зависимый фермент) и укажите

название всех ферментных комплексов.

9. Лекарственные препараты – производные барбитуровой кислоты:

А. Оказывают снотворное действие.

Б. Активируют тканевое дыхание.

В. Ингибируют НАДН-дегидрогнназу.

Д. Вызывают гипоэнергетическое состояние.

Ферменты являются белковыми катализаторами биохимических реакций, большая часть которых в отсутствие фермента протекала бы крайне медленно. В отличие от химических катализаторов каждый фермент способен катализировать лишь очень небольшое число реакций, часто только одну.

Таким образом, ферменты это реакционно-специфические катализаторы. Практически все биохимические реакции катализируются ферментами.

Многие ферменты оказывают каталитическое действие на субстраты только в присутствии специфического термостабильного низкомолекулярного органического соединения – кофермента.

В таких случаях холофермент (каталитически активный комплекс) состоит из апофермента (белковая часть) и связанного с ним кофермента (Приложение Н). Кофермент может быть связанным с апоферментом ковалентными и нековалентными связями. Термин «простетическая группа» относится к ковалентно связанному коферменту. К числу реакций, требующих присутствия кофермента, относятся: окислительно-восстановительные, переноса групп, изомеризации, а также реакции конденсации (по системе IUB это классы 1, 2, 5, 6). Реакции расщепления протекают в отсутствие коферментов (по системе IUB это классы 3 и 4).

^ 4.1 Лабораторная работа «Определение активности амилазы
солода по методу Вольгемута»

Метод Вольгемута основан на определении минимального количества фермента, способного при определенных условиях полностью гидролизовать 1 мл 0,1 %-ного раствора крахмала. Амилазная активность солода выражается количеством миллилитров 0,1 %-ного раствора крахмала, которое может быть гидролизовано 1 мл вытяжки из солода при температуре 38 °С в течение 30 мин. В норме амилазная активность равна от 160 до 320 единиц активности.

Метод Вольгемута широко используется в клинической практике для определения амилазной активности крови и мочи, в пивоварении – для определения амилазной активности солода. Резкое повышение амилазной активности в крови и моче (в 10–30 раз) наблюдается при острых панкреатитах, опухолях поджелудочной железы.

^ Материалы и реактивы: вытяжка из солода зерновых, разбавленная в 10 раз; 0,1 %-ный раствор крахмала; 0,1 %-ный раствор йода в 0,2 %-ном растворе иодида калия.

Оборудование: штатив с пробирками, пипетки, капельницы, термостат.

^ Ход работы. В десять пробирок наливают по 1 мл дистиллированной воды. В первую пробирку прибавляют 1 мл разведенной в 10 раз вытяжки, перемешивают, 1 мл смеси переносят во вторую пробирку. Содержимое этой пробирки снова перемешивают и 1 мл переносят в третью пробирку и так до десятой пробирки. Из последней пробирки отбирают 1 мл и выливают. Таким образом, в каждой последующей пробирке содержание фермента в два раза меньше, чем в предыдущей. Разведение вытяжки в десяти пробирках составит: 1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; 1:320; 1:640; 1:1280; 1:2560; 1:5120; 1:10240.

Далее во все пробирки прибавляют по 1 мл воды и по 2 мл раствора крахмала, перемешивают и помещают в термостат при температуре 38 °С на 30 мин. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой для прекращения действия фермента, добавляют по две капли раствора йода, хорошо взбалтывают и наблюдают за изменением окраски. При реакции с йодом жидкость окрашивается в желтый, розовый и фиолетовый цвет.

Отметив, при каком разведении произошел полный гидролиз крахмала с минимальным содержанием фермента (пробирка с желтоватой окраской содержимого), по количеству неразведенной вытяжки (А) в данной пробирке рассчитывают амилазную активность вытяжки
(А мл вытяжки расщепляет Х мл 0,1 %-ного раствора крахмала).

Например, желтый цвет появился в четвертой пробирке, где вытяжка разведена в 160 раз. Это количество вытяжки способно гидролизовать 2 мл 0,1 %-ного раствора крахмала, а 1 мл неразведенной вытяжки в тех же условиях гидролизует 320 мл: Х = 2×160/1. Следовательно, амилазная активность равна 320.

^ 4.2 Лабораторная работа «Определение активности каталазы

по Баху»

Метод основан на определении количества пероксида водорода, оставшегося после действия на него каталазы, титрованием на него раствора KMnO 4 . Реакция протекает по уравнению

1 мл 0,1 моль/л раствора перманганата калия соответствует 85 мг пероксида водорода.

^ Материалы и реактивы: препарат каталазы (1 г проростков солода ячменного растирают в фарфоровой ступке с 6 мл фосфатного буфера и фильтруют); 10 %-ный раствор H 2 SO 4 ; 0,1 %-ный раствор пероксида водорода на фосфатном буфере, pH=7,0 (35,0 мл 0,2 моль/л NaH 2 PO 4 в 13,6 мл 0,2 моль/л NaH 2 PO 4); 0,1 моль/л раствор KMnO 4 .

Оборудование: колбы емкостью 100 мл, пипетки, бюретки, термостат.

^ Ход работы. В две колбы вносят по 2 мл препарата каталазы, в одну из них (проба) прибавляют 1 мл 10%-ного раствора H 2 SO 4 , затем наливают по 2 мл раствора пероксида водорода в каждую колбу, ставят в термостат на 40 мин при температуре 38 °С. По истечении времени инкубации во вторую колбу (контроль) прибавляют 1 мл 10 %-ного раствора H 2 SO 4 и оба раствора титруют 0,1 моль/л раствором KMnO 4 до появления стойкого розового окрашивания от излишка перманганата калия.

Активность каталазы определяют по количеству разложенного пероксида водорода (мл) и рассчитывают по формуле:

,

Где
– разность результатов титрования контрольного и исследуемого образцов 0,001 н раствором KMnO 4 , мл;

Q – количество пероксида водорода (85 мг), соответствующее
1 мл 0,1 моль/л раствора KMnO 4 .

^ 4.3 Лабораторная работа «Капельный метод
(по Климовскому и Родзевич)»

Амилолитическая активность, обусловленная в основном наличием в препарате α-амилазы, характеризует способность фермента катализировать гидролиз крахмала до неокрашиваемых йодом продуктов. При наличии в препарате α-амилазы и глюкоамилазы этим методом определяется суммарное действие всех амилолитических ферментов.

За единицу амилолитической активности в этом методе принято такое количество фермента, которое катализирует расщепление 1 г растворимого крахмала до продуктов, неокрашиваемых йодом, за 1 час при температуре 30 ºС в строго определенных условиях. Амилолитическую активность АС выражают числом указанных единиц в 1 г препарата, культуры или в 1 см 3 раствора. Величина АС показывает, сколько граммов крахмала может быть гидролизовано до неокрашиваемых йодом соединений 1 г препарата, культуры или 1 см 3 раствора за 1 ч в условиях определения. Окончание реакции контролируют визуально по йодной пробе.

Чувствительность метода определяют минимальным количеством времени, за которое можно визуально уловить изменение окраски йода. Допускают, что скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна количеству применяемого фермента и остается постоянной на протяжении от 5 мин до 1 ч, то есть реакция подчиняется закону реакции нулевого порядка. Кроме того, установлено влияние величины рН и химической природы буфера на величину АС. С ацетатным буфером (рН=4,7) величина АС у грибных препаратов в среднем в 1,5 раза выше, чем при определении с фосфатным буфером (рН=6,0). Поэтому, при определении величины АС грибных культур рекомендуется брать ацетатный буфер.

Недостатком метода является нечеткость визуального определения окончания реакции.

^ Материалы и реактивы: ацетатный буфер с рН=4,7 для ферментов грибного происхождения; фосфатный буфер с рН=6,0 для ферментов бактериального происхождения; 1 %-ный раствор крахмала (раствор крахмала, употребляемый для анализа грибных препаратов, должен иметь рН=4,7, для анализа бактериальных препаратов – 6,0); растворы йода. Для приготовления основного раствора йода в тарированный стаканчик с притертой крышкой отвешивают 4,4 г йодида калия, 1,4 г металлического йода, добавляют около 2 см 3 дистиллированной воды. Стаканчик закрывают крышкой, содержимое перемешивают и после растворения йода переводят раствор в мерную колбу объемом 100 см 3 с притертой пробкой. Доводят объем дистиллированной водой до метки. Содержимое колбы хранят в темном прохладном месте. Основным раствором йода можно пользоваться в течение 30 дней со дня его приготовления. Рабочий раствор йода готовят из основного раствора. Для этого 20 см 3 основного раствора йода наливают в мерную колбу вместимостью 100 см 3 , добавляют 4,4 г йодида калия и доводят общий объем раствора до 100 см 3 . Рабочий раствор йода может быть употреблен в течение шести дней после его приготовления.

Оборудование: широкие пробирки, стеклянные палочки, пипетки, стаканы объемом 50 мл, чашки Петри, термостат.

^ Ход работы. Для определения значения АС важно строго соблюдать условия реакции. Для этого предварительно все растворы – субстрат (1 %-ный раствор крахмала), раствор фермента и дистиллированная вода должны быть нагреты до температуры 30 °С.

Субстрат в количестве 25 см 3 (12,5 мл) помещают в широкую пробирку, в которую вставлена стеклянная палочка. 30 см 3 (15 мл) вытяжки и 30 см 3 (15 мл) воды наливают в отдельные пробирки, помещают в термостат и выдерживают при температуре 30 ºС в течение
10 минут.

Затем в широкую пробирку к раствору крахмала, не вынимая пробирок из термостата, с помощью пипеток добавляют от 1 до 25 см 3 исходного ферментного раствора и соответствующее количество воды так, чтобы общий объем реакционной смеси был 50 см 3 . Если ферментная вытяжка малоактивна, то можно внести только ее в количестве 25 см 3 , а воду вообще не добавлять.

Содержимое пробирки перемешивают палочкой и отмечают время по секундомеру, когда была добавлена вытяжка к раствору крахмала. Через каждые 60 секунд из пробирки, не вынимая ее из термостата, отбирают палочкой каплю пробы. Каплю помещают на белую фарфоровую пластину, соединяют эту каплю с каплей рабочего раствора йода и наблюдают окраску. Реакция расщепления крахмала считается оконченной, когда йод перестает давать изменение окраски при соединении с каплей испытуемого раствора в течение первых 10 секунд. Изменение окраски отчетливо видно на границе соприкосновения двух капель – йода и реакционной смеси.

Время, за которое происходит расщепление крахмала до продуктов, не окрашивающихся йодом, должно быть в пределах от 10 до
20 минут.

Если время гидролиза менее 10 мин, определение повторяют, беря на гидролиз меньше вытяжки и больше воды. Если гидролиз не заканчивается в течение 20 мин, то анализ также повторяют, беря на определение больше ферментной вытяжки и меньше воды. Количество ферментной вытяжки, которое необходимо брать на повторный анализ, вычисляют с учетом полученного времени гидролиза.

Если ферментная вытяжка имеет малую или слишком высокую активность, и количество ферментного раствора от 1 до 25 см 3 не обеспечивает длительности гидролиза крахмала в течение 10…20 мин, то для анализа берут не 25 см 3 раствора крахмала, а большее или меньшее его количество, например, 10 или 40 см 3 , внося соответствующую поправку в расчетную формулу (соответственно 0,1 или 0,4 вместо, обычных 0,25).

Величину значения амилолитической активности АС (ед./г) рассчитывают по формуле:

Где 0,25 – количество крахмала, которое находится в 25 см 3 1 %-ного раствора, г;

60 – коэффициент пересчета на 1 ч;

N – количество фермента, участвующего в реакции, г или см 3 (эта величина определяется с учетом концентрации исходной вытяжки и последующего разведения);

T – время, за которое произошло расщепление крахмала до не окрашиваемых йодом продуктов, мин.

Пример. Для анализа взята ферментная вытяжка воздушной культуры гриба. Исходный раствор приготовлен из расчета 5 г культуры в 100 см 3 забуференной воды. Известно, что данная культура очень активна, поэтому сделано дополнительное разведение исходного раствора: 20 см 3 доведено в мерной колбе до 50 см 3 дистиллированной водой и оттуда на анализ взято 2 см 3 , т.е. получена такая последовательность разведения:

5 г → 100 см 3 → 20 см 3 → 50 см 3 → 2 см 3 .

Для гидролиза 0,25 крахмала (25 см 3 1 %-ного раствора крахмала) ферментным раствором последнего разведения (2 см 3) потребовалось 12 мин. Тогда АС воздушно-сухой культуры (ед./г) составит:

При пересчете ферментативной активности следует учитывать не абсолютно сухое вещество ферментного препарата, а с учетом влажности. Расчет следует производить по формуле:

,

Где W – влажность культуры или препарата.

^ 4.4 Лабораторная работа «Метод Вильштеттера
и Вальдшмидта-Лейтца определения протеолитической
активности ферментов в модификации»

Метод основан на определении свободных карбоксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и полипептидов.

Активность (ПС) выражается количеством миллиграммов аминного азота, которое образуется при гидролизе определенного количества 5 %-ного раствора желатина с величиной рН от 7,3 до 7,5 1 г препарата или 1 см 3 ферментного раствора за 1 ч при температуре 40 ºС.

За единицу протеолитической активности принимается количество фермента, которое образует 1 мг аминного азота за 1 ч при принятых условиях опыта.

^ Материалы и реактивы: 96 %-ный этиловый спирт; 1 %-ный раствор тимолфталеина; 0,1 н раствор NaOH; субстрат – 5 %-ный раствор желатина; вытяжка из анализируемого растения.

Приготовление вытяжки для определения протеолитической активности: навеска 0,25 г растительного материала помещается в фарфоровую ступку и растирается в течение 2,5 мин с 2,5 мл фосфатного буфера (рН=7,3), далее масса фильтруется.

Приготовление 5 %-ного раствора желатина (субстрат): 5 г желатина предварительно замачивается в стеклянном стаканчике в 15…20 см 3 дистиллированной воды в течение 20…30 мин. Набухший белок заливается 20…25 см 3 буферного раствора с температурой от 70 до 80 °С и тщательно перемешивается стеклянной палочкой. Растворившаяся часть сливается в мерную колбу объемом 100 см 3 , к нерастворившейся части добавляется еще 20…25 см 3 буферного раствора, и полученный раствор снова переносится в эту же колбу. Охлажденный до 40 °С раствор желатина доводится до метки буферным раствором такой же температуры. Готовый раствор желатина хранится в холодильнике при температуре от 2 до 5 °С и используется для анализа в течение двух суток. Перед анализом раствор желатина нагревается до температуры 40 °С на водяной бане.

Оборудование: конические колбы объемом от 200 до 250 мл, мерные колбы объемом 50 мл, стеклянные палочки, пипетки, бюретки, термостат.

^ Ход работы. К 10 см 3 5 %-ного раствора желатина с величиной рН от 7,3 до 7,5 приливают 2 см 3 испытуемого ферментного раствора и сразу же отбирают 1 см 3 реакционной смеси в коническую колбу емкостью от 50 до 100 см 3 , куда предварительно наливают 20 см 3 96 %-ного этилового спирта и 0,2 см 3 1 %-ного тимолфталеина. Пробу титруют 0,1 н раствором NaOH до появления голубой окраски.

Оставшуюся смесь желатина с ферментным раствором помещают в термостат с температурой 40 ºС для гидролиза. Через 3 ч 1 см 3 реакционной смеси отбирают во вторую колбу емкостью от 50 до 100 см 3 , куда предварительно наливают 20 см 3 96 %-ного этилового спирта и 0,2 см 3 1 %-ного тимолфталеина. Пробу титруют, как в случае контрольного варианта.

Расчет протеолитической активности ПС проводят по формуле:

,

Где А – количество аминного азота, накопленного за время опыта из реакционной среды, мл;

T – продолжительность протеолиза, ч;

Р – коэффициент, учитывающий разведение и пересчет на 1 г препарата или 1 см 3 жидкого ферментного раствора.

Величину А рассчитывают по формуле:

,

Где а – количество 0,1 н раствора NaOH, пошедшее на титрование 1 см 3 опытной пробы, см 3 ;

А к – то же для контрольной пробы;

1,4 – коэффициент пересчета количества 0,1 н раствора щелочи в миллиграммы азота аминокислот и полипептидов;

К – поправка к титру щелочи.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение активности каталазы (1.11.1.6)

1) с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа (метод Баха и Зубковой)

ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах, а также во всех тканях и жидкостях организма. Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании пероксида водорода (Н 2 О 2 ) путем его разложения на молекулярный кислород и воду:

2Н 2 О 2 → О 2 + 2Н 2 О

Активность энзима выражают, используя каталазное число и показатель каталазы. Каталазным числом называют количество мг пероксида водорода, которое расщепляется 1,0 мкл крови за определенный промежуток времени. О количестве расщепленного пероксида водорода судят по разности количества перманганата калия, пошедшего на титрование контрольной и опытной проб.

Показателем каталазы называют соотношение каталазного числа к количеству миллионов эритроцитов в 1,0 мкл исследуемой крови.

Реактивы : 1) 1% раствор Н 2 О 2 ; 2) 10% раствор серной кислоты ; 3) 0,1 М раствор перманганата калия (для титрования).

Объект исследования: гемолизат, полученный разведением крови дистиллированной водой в соотношении 1:1000.

Приготовление : в мерную колбу на 100 мл наливают 10 мл дистиллированной воды и прибавляют микропипеткой 0,1 мл крови. Пипетку промывают несколько раз тем же раствором. Воду прибавляют в колбу до метки и получают основной раствор крови (1:1000), который используется для определения каталазного числа.

Ход работы.

В две колбы для титрования (опыт и контроль) наливают по 7 мл воды и в каждую прибавляют по 1 мл основного раствора крови. В каждую колбу вносят точно по 2 мл. В контрольную колбу добавляют 3 мл для расщепления каталазы. Обе колбы инкубируют при комнатной температуре 30 минут. Затем в опытную колбу наливают 3 мл 10% раствора сульфатной кислоты. Содержимое обеих колб титруют 0,1 М раствором перманганата калия до появления розового окрашивания. Умножают разницу между результатами опыта и контроля на 1,7 и получают каталазное число крови.

Пример расчета : моль-эквивалент Н 2 О 2 равняется 17 г. Значит, в 1 мл 0,1 М раствора содержится 1,7 мг Н 2 О 2 ; умножив 1,7 на разницу между количеством мл 0,1 М раствора калий перманганата, пошедшего на титрование содержимого контрольной и опытной колб, получают количество мг Н 2 О 2 , которое расщепляется 1 мкл исследуемой крови, то есть сразу рассчитывают каталазное число.

Нормы : каталазное число составляет от 10 до 15 единиц,

Показатель каталазы составляет 2-3х10 -:6 , в клинике его используют чаще

Клинико-диагностическое значение. Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной и макроцитарной анемии, а также при введении в организм алкоголя, кофеина, ацетоновых тел. Активность каталазы в крови снижается при раке, анемии, туберкулезе и других заболеваниях.

2) с использованием молибдата аммония

Каталаза – один из наиболее филогенетически древних ферментов антиоксидантной системы организма, относится к классу оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-восстановительные реакции, входит в группу гидропероксидаз, использующих в качестве субстрата Н 2 О 2 (2 Н 2 О 2 → 2 Н 2 О + О 2 ) или органические гидроперекиси, поэтому наряду с каталазной обладает пероксидазной активностью. По структуре – гемопротеин, содержащий 4 гемовые группы. Каталаза является внутриклеточным ферментом. В циркулирующей крови бóльшая доля фермента локализована в цитоплазме эритроцитов.

Функции каталазы:

Участвует в защите организма от эндогенной перекиси водорода, образующейся в результате функционирования аэробных дегидрогеназ;

Подавляет образование гидроксильных радикалов;

Защищает от окисления гемоглобин и способствует переносу кислорода внутри клеточных структур;

Участвует в окислительном метаболизме некоторых аминокислот;

Предохраняет от окисления SH-группы, в том числе, входящие в активный центр многих ферментов и функционально активных белков.

Принцип метода. Активность каталазы определяется по преобразованию ферментом субстрата (пероксида водорода), который способен к образованию окрашенного комплекса с солями молибдата аммония.

Реагенты. 1) 0,03 % раствор Н 2 О 2 ; 2) 4 % раствор молибдата аммония.

Биологический материал: сыворотка крови.

Ход работы. Опытная проба: к 2,0 мл 0,03 % раствора перекиси водорода добавить 0,1 мл сыворотки. В холостую пробу вместо сыворотки – 0,1 мл дистиллированной воды. В контрольную пробу вместо перекиси добавляют 2,0 мл дистиллированной воды. Пробы инкубировать 10 мин при 37 ° С, затем остановить реакцию добавлением 1,0 мл 4% раствора молибдата аммония. Центрифугировать 10 мин при 4000 об/мин. Измерить оптическую плотность холостой и опытной проб против контроля при длине волны 410 нм.

Расчёт активности каталазы в сыворотке крови:

А (мкат/л) = ,

где Е оп и Е хол - экстинкции опытной и холостой проб,

3,1 – общее разведение,

Т - время инкубации, с,

V - объём вносимой пробы, л,

22,210 3 – коэффициент экстинкции, ммоль –1 см –1 .

Активность каталазы в сыворотке крови 2,6 + 0,5 мкат/л

Оформление работы.

Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.

Приложение №1.

И н с т р у к ц и я по проведению лабораторной работы.

Лабораторная работа №3

Тема:

Цель: сформировать знания о роли ферментов в клетках; выяснить ферментативные свойства белков-пероксидаз; закрепить умение работать с микроскопом; проводить опыты и объяснять результаты работы.

Оборудование: свежий 3%-ный раствор пероксида водорода, пробирки, пинцет, ткани растений (кусочки сырого и варёного картофеля) и животных (кусочки сырого и варёного мяса), песок, ступка и пестик.

Дополнительные сведения: пероксид водорода образуется в клетке в процессе обмена веществ, обладает мутагенным действием. Н2О2 - вещество химически нестойкое и способно самопроизвольно разлагаться с образованием устойчивых соединений: 2 Н2О2 = 2 Н2О + О2

Х о д р а б о т ы.

1. Приготовьте четыре пробирки со свежим 3%-ный раствором пероксида водорода, затем поместите в первую пробирку кусочек сырого картофеля, во вторую – кусочек варёного картофеля, в третью – кусочек сырого мяса, в четвёртую – кусочек варёного мяса. Пронаблюдайте, что будет происходить в каждой пробирке.

2. Составьте таблицу, показывающую активность каждой ткани при различной обработке.

3. Измельчите в ступке кусочек сырого картофеля с небольшим количеством песка. Перенесите измельчённый картофель вместе с песком в пробирку и капните туда немного пероксида водорода. Сравните активность измельчённой и целой растительной ткани.

4. Объясните полученные результаты.

Ответьте на вопросы:

Как проявляется активность ферментов в живых и мёртвых тканях?

Различается ли активность ферментов в растительных и животных тканях?

Как влияет измельчение ткани на активность фермента?

Как бы вы предложили измерить скорость разложения пероксида водорода?

Как вы считаете, все ли живые организмы содержат фермент пероксидазу,

обеспечивающий разложение пероксида водорода?

Образец отчёта по лабораторной работе

«Каталитическая активность ферментов в живых тканях»

Что делали?	Что наблюдали?
1. В пробирку с раствором Н2О2 положили кусочек сырого картофеля.		В клетках картофеля присутствуют ферменты, ускоряющие расщепление Н2О2: 2 Н2О2 = 2 Н2О + О2
2. В пробирку с раствором Н2О2 положили кусочек варёного картофеля.		Ферменты утратили свои каталитические свойства: при варке от нагревания произошла денатурация белков.
3. В пробирку с раствором Н2О2 положили кусочек сырого мяса.	Бурное выделение пузырьков кислорода.	В клетках мышечной ткани животного есть ферменты, ускоряющие расщепление Н2О2: 2 Н2О2 = 2 Н2О + О2
4. В пробирку с раствором Н2О2 положили кусочек варёного мяса.	Изменений с раствором не происходит. Признаков разложения Н2О2 нет.	При варке ферменты потеряли свою каталитическую активность вследствие денатурации белковых молекул.
5. В пробирку с раствором Н2О2 положили кусочек измельчённого сырого картофеля.	Выделение пузырьков кислорода стало более интенсивным чем до измельчения.	При измельчении клеток картофеля количество ферменты, ускоряющие расщепление Н2О2 увеличилось, поэтому скорость реакции стала больше: 2 Н2О2 = 2 Н2О + О2

Вывод: действие ферментов-пероксидаз сходно в растительных и животных клетках, общность физиологических процессов – одно из доказательств родственных связей между растительными и животными организмами.

Определение активности каталазы

(по А.Н. Баху и А.И. Опарину)

Оксидоредуктазы – класс ферментов катализирующих окислительно-восстановительные реакции. Окисление мономеров, образующихся в процессе катаболизма полимеров, представляет собой сложный многоступенчатый процесс.

Окисление веществ в клетках протекает, в основном, путем отщепления водорода (дегидрированием) или отщеплением электронов или путем присоединения кислорода к молекуле окисляемого соединения.

Акцепторами водорода у дегидрогеназ является НАД + , НАДФ, ФАД и ФМН, у некоторых флавиновых – кислород (их называют оксидазами), у гемсодержащих (пероксидаз и каталазы) – Н 2 О 2 (пероксид водорода).

Акцепторами и переносчиками электронов являются цитохромы, содержащие гем (гемопротеины).

Каталаза (КФ 1.11.1.6) относится к гемопротеинам, катализирует процесс разрушения ядовитого для клеток пероксида водорода на воду и кислород: 2 H 2 O 2 = 2 H 2 O + O 2 .

Для живой клетки пероксид водорода является сильным ядом, поэтому все ферменты образующие и обезвреживающие Н 2 О 2 находятся в пероксисомах – органеллах покрытых мембраной. Главными потребителями Н 2 О 2 являются пероксидазы (КФ 1.11.1.7.), которые окисляют фенолы, амины, некоторые гетероциклические соединения и др. субстраты дегидрированием, переносят снятые с субстратов на Н 2 О 2 , восстанавливая его до 2 Н 2 О. Молекулы пероксида водорода, невостребованные пероксидазами, обезвреживаются каталазой.

Метод определения активности каталазы основан на определении количества пероксида водорода, расщепленного в процессе инкубации с ферментом. Количество H 2 O 2 в реакционной смеси определяют титрованием в кислой среде раствором с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л:

5 H 2 O 2 + 2KMnO 4 + 3H 2 SO 4 = 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + 5O 2 +8H 2 O

На основании приведенного уравнения реакции можно рассчитать, что 1 мл раствора с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л соответствует 1,7 мг (50 мкмоль) пероксида водорода.

ХОД РАБОТЫ. 2-3 г сырого картофеля (или другого свежего растительного материала) тщательно растирают в ступке с кварцевым песком или стеклом. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике скальпеля CaCO 3 до прекращения выделения пузырьков СО 2 . В процессе растирания в ступку добавляют небольшими порциями 40-50 мл воды. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят водой до метки и перемешивают. Смесь оставляют стоять 10-15 мин и после перемешивания фильтруют.

Берут две конические колбочки вместимостью 150-200 мл и вносят в них по 20 мл полученного фильтрата. Содержимое одной колбы кипятят в течение 1 мин и охлаждают до комнатной температуры (контроль). Другая колба опытная содержит активный фермент. К содержимому опытной и контрольной колб приливают по 20 мл воды и по 3 мл раствора с массовой долей H 2 O 2 1 %. Содержимое тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. По окончании инкубации в обе колбы добавляют по 5 мл раствора с массовой долей серной кислоты 10 %, перемешивают и избыток H 2 O 2 в каждой колбе оттитровывают раствором с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л до образования розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин.

Активность каталазы выражают в мкмоль пероксида водорода, расщепившегося под действием фермента в расчете на 1 г исследуемого материала (или на 1 мг вытяжки из него) за 1 мин. Вычисление ведут по формуле:

где Х – активность каталазы, Е/г;

(а-b) – разность между объемами раствора с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л, пошедшего на титрование контрольной (а) и опытной (b) проб, мл;

Т – титр примененного для титрования раствора перманганата калия;

50 – коэффициент пересчета на мкмоль H 2 O 2 ;

100 – общий объем приготовленного экстракта;

m – масса взятого для анализа материала, г;

20 – объем фильтрата, взятого для анализа, мл;

30 – время инкубации, мин.

Принцип определения, порядок анализа и результат анализа записывают.

Активность каталазы можно определить и по объему кислорода, выделившегося после прибавления к исследуемому объекту H 2 O 2 .

Этот принцип используют для определения активности каталазы в молоке, выражаемую каталазным числом, представляющим собой объем кислорода (мл) выделившийся за 2 часа при 25 °С из добавленных к 15 мл молока 5 мг раствора с массовой долей H 2 O 2 1 %. Молоко, полученное от здоровых животных, выделяет 0,7-2,5 мл кислорода, т.е. каталазное число натурального молока составляет не более 2,5. Молоко, полученное от больных животных (мастит и др.), и молозиво имеют повышенные каталазные числа, достигающие до 15.

РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; кальций углекислый (порошок); раствор с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л; растворы с массовыми долями: пероксида водорода 1 % (10 мл раствора с массовой долей H 2 O 2 30 % разбавить водой до 300 мл), серной кислоты 10 %.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. Основные пути окисления субстратов в клетке.

2. Характеристика строения и действия НАД + - и НАДФ-зависимых дегидрогеназ.

3. Характеристика строения и действия ФАД-зависимых дегидрогеназ.

4. Какие ферменты называют оксидазами? Их кофакторы.

5. Характеристика строения и действия пероксидаз и каталаз.

6. Характеристика строения и действия цитохромов.

7. Химизм, образование и пути обезвреживания пероксида водорода в клетках.

8. Метод определения активности каталазы.